কী পার্থক্য - স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিং বনাম পাইরোসকোয়েন্সিং
ডিএনএ সিকোয়েন্সিং ডিএনএ বিশ্লেষণের জন্য অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ কারণ একটি নির্দিষ্ট ডিএনএ অঞ্চলে সঠিক নিউক্লিওটাইড বিন্যাসের জ্ঞান এটি সম্পর্কে অনেক গুরুত্বপূর্ণ তথ্য প্রকাশ করে। বিভিন্ন ডিএনএ সিকোয়েন্সিং পদ্ধতি আছে। স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিং এবং পাইরোসকোয়েন্সিং হল দুটি ভিন্ন ডিএনএ সিকোয়েন্সিং পদ্ধতি যা মলিকুলার বায়োলজিতে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়। সেঞ্জার সিকোয়েন্সিং এবং পাইরোসকোয়েন্সিং এর মধ্যে মূল পার্থক্য হল সেঞ্জার সিকোয়েন্সিং নিউক্লিওটাইড সিকোয়েন্স পড়ার জন্য ডিএনএ এর সংশ্লেষণ বন্ধ করতে ডিডিঅক্সিনিউক্লিওটাইড ব্যবহার করে যখন পাইরোসকোয়েন্সিং নিউক্লিওটাইডগুলিকে অন্তর্ভুক্ত করে পাইরোফসফেট রিলিজ সনাক্ত করে এবং রিডিং ইকুয়েন্সের পূর্ববর্তী ক্রমকে সংশ্লেষণ করে।
স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিং কি?
স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিং হল একটি প্রথম প্রজন্মের ডিএনএ সিকোয়েন্সিং পদ্ধতি যা ফ্রেডরিক স্যাঙ্গার এবং তার কলেজগুলি 1977 সালে তৈরি করেছিল। এটি চেইন টার্মিনেশন সিকোয়েন্সিং বা ডাইডোক্সি সিকোয়েন্সিং নামেও পরিচিত কারণ এটি ডিডিঅক্সিনিউক্লিওটাইডস (ডিডিএনটিপি) দ্বারা চেইন টার্মিনেশনের উপর ভিত্তি করে। নিউ জেনারেশন সিকোয়েন্সিং (এনজিএস) তৈরি না হওয়া পর্যন্ত এই পদ্ধতিটি 30 বছরেরও বেশি সময় ধরে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। সেঞ্জার সিকোয়েন্সিং কৌশল সঠিক নিউক্লিওটাইড অর্ডার বা একটি নির্দিষ্ট ডিএনএ খণ্ডের সংযুক্তি আবিষ্কার করতে সক্ষম করেছে। এটি ddNTP-এর নির্বাচনী সংযোজন এবং ইন ভিট্রো ডিএনএ প্রতিলিপির সময় ডিএনএ সংশ্লেষণের সমাপ্তির উপর ভিত্তি করে। সংলগ্ন নিউক্লিওটাইডগুলির মধ্যে ফসফোডিস্টার বন্ড গঠন চালিয়ে যাওয়ার জন্য 3’ OH গ্রুপের অনুপস্থিতি ডিডিএনটিপিগুলির একটি অনন্য বৈশিষ্ট্য। তাই, একবার ডিডিএনটিপি সংযুক্ত হয়ে গেলে, চেইন প্রসারণ বন্ধ হয়ে যায় এবং সেই বিন্দু থেকে শেষ হয়। চারটি ddNTP আছে - ddATP, ddCTP, ddGTP এবং ddTTP - সেঞ্জার সিকোয়েন্সিংয়ে ব্যবহৃত হয়। এই নিউক্লিওটাইডগুলি যখন DNA-এর ক্রমবর্ধমান স্ট্র্যান্ডে একত্রিত হয় তখন DNA প্রতিলিপি প্রক্রিয়া বন্ধ করে দেয় এবং এর ফলে ছোট DNA এর দৈর্ঘ্য পরিবর্তিত হয়।ক্যাপিলারি জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস এই ছোট ডিএনএ স্ট্র্যান্ডগুলিকে তাদের আকার অনুসারে জেলের উপর সংগঠিত করতে ব্যবহৃত হয় যা চিত্র 01-এ দেখানো হয়েছে।
চিত্র 1: সংশ্লেষিত ছোট ডিএনএর কৈশিক জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস
ডিএনএর ইন ভিট্রো প্রতিলিপির জন্য, কিছু প্রয়োজনীয়তা প্রদান করা উচিত। এগুলি হল ডিএনএ পলিমারেজ এনজাইম, টেমপ্লেট ডিএনএ, অলিগোনিউক্লিওটাইড প্রাইমার এবং ডিঅক্সিনিউক্লিওটাইডস (ডিএনটিপি)। সেঞ্জার সিকোয়েন্সিং-এ, ডিএনএ প্রতিলিপি চারটি পৃথক টেস্ট টিউবে চার ধরনের ডিডিএনটিপি-র সাথে আলাদাভাবে সঞ্চালিত হয়। Deoxynucleotides সম্পূর্ণরূপে সংশ্লিষ্ট ddNTP দ্বারা প্রতিস্থাপিত হয় না। নির্দিষ্ট dNTP এর একটি মিশ্রণ (উদাহরণস্বরূপ; dATP + ddATP) টিউবে অন্তর্ভুক্ত করা হয় এবং প্রতিলিপি করা হয়। চারটি পৃথক নল পণ্য চারটি পৃথক কূপে একটি জেলে চালিত হয়। তারপর জেলটি পড়ে, চিত্র 02-এ দেখানো হিসাবে ক্রমটি তৈরি করা যেতে পারে।
চিত্র 02: স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিং
স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিং একটি গুরুত্বপূর্ণ কৌশল যা আণবিক জীববিজ্ঞানের অনেক ক্ষেত্রে সাহায্য করে। মানব জিনোম প্রকল্প সফলভাবে সম্পন্ন হয়েছে স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিং-ভিত্তিক পদ্ধতির সাহায্যে। স্যাঞ্জার সিকোয়েন্সিং টার্গেট ডিএনএ সিকোয়েন্সিং, ক্যান্সার এবং জেনেটিক ডিজিজ রিসার্চ, জিন এক্সপ্রেশন অ্যানালাইসিস, হিউম্যান আইডেন্টিফিকেশন, প্যাথোজেন ডিটেকশন, মাইক্রোবিয়াল সিকোয়েন্সিং ইত্যাদিতেও কার্যকর।
স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিংয়ের বেশ কিছু অসুবিধা রয়েছে:
- ডিএনএর দৈর্ঘ্য ক্রমানুসারে 1000 বেস জোড়ার বেশি হতে পারে না
- একবারে শুধুমাত্র একটি স্ট্র্যান্ড সিকোয়েন্স করা যায়।
- প্রক্রিয়াটি সময়সাপেক্ষ এবং ব্যয়বহুল৷
অতএব, এই সমস্যাগুলি কাটিয়ে উঠতে সময়ের সাথে সাথে নতুন উন্নত সিকোয়েন্সিং কৌশলগুলি তৈরি করা হয়েছিল। যাইহোক, প্রায় 850 বেস পেয়ার দৈর্ঘ্যের টুকরো পর্যন্ত অত্যন্ত নির্ভুল ফলাফলের কারণে স্যাঞ্জার সিকোয়েন্সিং এখনও ব্যবহার করা হচ্ছে।
Pyrosequencing কি?
Pyrosequencing একটি অভিনব ডিএনএ সিকোয়েন্সিং কৌশল যা "সংশ্লেষণ দ্বারা সিকোয়েন্সিং" এর উপর ভিত্তি করে। এই কৌশলটি নিউক্লিওটাইড অন্তর্ভুক্তির উপর পাইরোফসফেট রিলিজ সনাক্তকরণের উপর নির্ভর করে। প্রক্রিয়াটি চারটি ভিন্ন এনজাইম দ্বারা নিযুক্ত করা হয়: ডিএনএ পলিমারস, এটিপি সালফিরালেজ, লুসিফেরেজ এবং অ্যাপারেজ এবং দুটি সাবস্ট্রেট অ্যাডেনোসিন 5’ ফসফসালফেট (এপিএস) এবং লুসিফেরিন।
প্রক্রিয়াটি শুরু হয় প্রাইমারের সাথে একক-স্ট্রেন্ডেড ডিএনএ টেমপ্লেটের সাথে বাঁধাই করার মাধ্যমে এবং ডিএনএ পলিমারেজ এটির পরিপূরক নিউক্লিওটাইডগুলির সংযোজন শুরু করে। যখন নিউক্লিওটাইডগুলি একত্রে যোগ দেয় (নিউক্লিক অ্যাসিড পলিমারাইজেশন), তখন এটি পাইরোফসফেট (দুটি ফসফেট গ্রুপ একত্রে আবদ্ধ) গ্রুপ এবং শক্তি প্রকাশ করে।প্রতিটি নিউক্লিওটাইড সংযোজন সমান পরিমাণে পাইরোফসফেট প্রকাশ করে। Pyrophosphate ATP সাবস্ট্রেট APS এর উপস্থিতিতে ATP সালফারিলেজ দ্বারা ATP-তে রূপান্তরিত হয়। উত্পন্ন ATP লুসিফেরেজ-মধ্যস্থতায় লুসিফেরিনকে অক্সিলুসিফেরিনে রূপান্তরিত করে, এটিপি-এর পরিমাণের সমানুপাতিক পরিমাণে দৃশ্যমান আলো তৈরি করে। আলো একটি ফোটন সনাক্তকরণ যন্ত্র বা ফটোমাল্টিপ্লায়ার দ্বারা সনাক্ত করা হয় এবং একটি পাইরোগ্রাম তৈরি করে। Apyrase বিক্রিয়া মিশ্রণে ATP এবং অ-নিগমিত dNTP গুলিকে হ্রাস করে। dNTP সংযোজন একবারে করা হয়। যেহেতু নিউক্লিওটাইডের সংযোজন আলোর সংযোজন এবং সনাক্তকরণ অনুসারে পরিচিত, তাই টেমপ্লেটের ক্রম নির্ধারণ করা যেতে পারে। Pyrogram নমুনা DNA এর নিউক্লিওটাইড ক্রম তৈরি করতে ব্যবহৃত হয় যেমন চিত্র 03 এ দেখানো হয়েছে।
Pyrosequencing একক নিউক্লিওটাইড পলিমরফিজম বিশ্লেষণ এবং ডিএনএ-এর সংক্ষিপ্ত প্রসারিত সিকোয়েন্সিং-এ অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ। উচ্চ নির্ভুলতা, নমনীয়তা, স্বয়ংক্রিয়তার সহজতা এবং সমান্তরাল প্রক্রিয়াকরণ হল সেঞ্জার সিকোয়েন্সিং কৌশলগুলির তুলনায় পাইরোসকোয়েন্সিংয়ের সুবিধা৷
চিত্র 03: পাইরোসকোয়েন্সিং
স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিং এবং পাইরোসকোয়েন্সিংয়ের মধ্যে পার্থক্য কী?
স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিং বনাম পাইরোসকোয়েন্সিং |
|
| স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিং হল একটি ডিএনএ সিকোয়েন্সিং পদ্ধতি যা ডিএনএ পলিমারেজ এবং চেইন টার্মিনেশনের মাধ্যমে ডিডিএনটিপিগুলির নির্বাচনী সংযোজনের উপর ভিত্তি করে। | পাইরোসকোয়েন্সিং হল একটি ডিএনএ সিকোয়েন্সিং পদ্ধতি যা নিউক্লিওটাইডের সংমিশ্রণে পাইরোফসফেট নিঃসরণ সনাক্তকরণের উপর ভিত্তি করে। |
| ddNTP এর ব্যবহার | |
| ddNTPs ডিএনএ প্রতিলিপি বন্ধ করতে ব্যবহার করা হয় | ddNTP ব্যবহার করা হয় না। |
| এনজাইম জড়িত | |
| DNA পলিমারেজ ব্যবহার করা হয়। | চারটি এনজাইম ব্যবহার করা হয়: ডিএনএ পলিমারেজ, এটিপি সালফারিলেজ, লুসিফেরেজ এবং অ্যাপারেজ। |
| ব্যবহৃত সাবস্ট্রেট | |
| APS এবং Luciferin ব্যবহার করা হয় না। | Adenosine 5’ ফসফসালফেট (APS) এবং লুসিফেরিন ব্যবহার করা হয়। |
| সর্বোচ্চ তাপমাত্রা | |
| এটি একটি ধীর প্রক্রিয়া। | এটি একটি দ্রুত প্রক্রিয়া। |
সারাংশ – স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিং বনাম পাইরোসকোয়েন্সিং
স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিং এবং পাইরোসকোয়েন্সিং হল দুটি ডিএনএ সিকোয়েন্সিং পদ্ধতি যা আণবিক জীববিজ্ঞানে ব্যবহৃত হয়। সেঞ্জার সিকোয়েন্সিং ক্রমানুসারে নিউক্লিওটাইডের ক্রম তৈরি করে চেইন প্রসারণকে শেষ করে যখন পাইরোসেকোয়েন্সিং নিউক্লিওটাইডগুলিকে একত্রিত করে এবং পাইরোফসফেটগুলির মুক্তি সনাক্ত করে ক্রমানুসারে নিউক্লিওটাইডগুলির সুনির্দিষ্ট ক্রম তৈরি করে।অতএব, স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিং এবং পাইরোসকোয়েন্সিং এর মধ্যে প্রধান পার্থক্য হল যে স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিং চেইন টার্মিনেশন দ্বারা সিকোয়েন্সিং এর উপর কাজ করে যখন পাইরোসেকোয়েন্সিং কাজ করে সংশ্লেষণের মাধ্যমে সিকোয়েন্সিং এর উপর।
